二维色谱总结 第1篇

抗体偶联药物是复杂的异质性药物。其固有的复杂性需要多种互补的分析方法来对其表征，其中包括LC和MS。与1维相比，xxx液相是一种非常有吸引力的技术，因为它可以结合两种色谱分离，从而最大限度地提高在一次分析中获得的信息。不同的正交组合在ADC的表征上体现着不同的价值。其中包括HIC -SEC、SEC-SEC、 HIC-RPLC、CEX-RPLC、HILIC-RPLC 和 RPLC-RPLC。2D-LC可作为一种快速的方法，通过在xxx度提供脱盐步骤，使不兼容的色谱可以与质谱在线连接，例如，使用HIC、SEC、CEX作为第一维度。此外，通过增加色谱分离空间，xxx度提供了前组分更多的信息。多功能二维在线液相连接HRMS 和 IMS，正在成为表征分析ADC的强大工具。

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二维色谱总结 第2篇

二维液相色谱的主要概念是：在第一个维度中获得的组分分离转移到第二个色谱柱进行第二次分离。理想情况下，所有未解析的分析物都会进一步被分离。为了成功地实现这一目标，两个耦合分离维度必须通过对化合物提供不同的选择性而相互补充。第一分离系统称为第一维，记为1D，第二分离系统称为xxx，记为2D。在二维LC系统中，二维可以离线耦合，也可以在线耦合。在离线模式下，第一维度分离的组分被收集并储存在小瓶中，后续再次注入到xxx度。同一个仪器(泵系统，样品管理器和检测器)可以通过改变固定相和/或流动相来实现这两个维度。在线模式下，样品的收集、转运、再回注可以做到实时连续进行。具体如图1所示：

与离线方法相比，在线方法更有优势，因为它避免了样品丢失、样品污染和样品降解的风险，而且更省时。但是，由于两个维度的相互依赖，在线样本处理可能会导致更加复杂的发生。因此，必须对每一维度都需要开发和优化特定的方法。

如图2所示：二维液相方法主要可以分为以下模式。

在完整水平上对ADC表征需要使用非变性分析技术保持蛋白质的结构和构象。变性条件包括物理参数(热、pH值、辐射等)及化学参数(还原剂如二硫苏糖醇(DTT)，强酸或强碱，高有机溶剂含量)，可能导致ADCxxx之间的弱非共价结合的解离和蛋白质的三维结构的破坏。各种色谱技术基本上是在水溶剂中进行的，因此，适合在完整水平上进行单克隆抗体或ADC分析。包括：HIC、IEX、CEX、SEC。

二维色谱总结 第3篇

对于ADC而言，除了DAR值分析外，聚体分析也是ADC的一个重要质量属性。单抗或ADC样品中尺寸异质性的表征主要依赖于SEC和非变性MS。与HIC相反，SEC可以用挥发性盐或非挥发性盐进行，但据报道，使用挥发性的盐(例如，乙酸铵缓冲液)SEC分离性能低于非挥发性的盐。使用挥发性盐，SEC峰会变宽，且保留时间延长。使用SEC-SEC，第一维SEC为非挥发性盐（磷酸盐，氯化钠），xxx为挥发性盐（醋酸铵）。如图6所示：SEC-SEC-IM-MS ，该方法可以鉴定出仅用SEC无法鉴别出的组分。

由图6(a)可以看到，峰1和峰2在xxx3前被洗脱。可以被认为是聚体（HMWS）。但是，通过MS发现，他们的分子量一样，均为单体，不是二聚体或者多聚体。但是，虽然都为单体，通过IMS可以看到，他们有不同的构象。将SEC分离提供的信息与原MS中完整质量测量的信息以及IMS提供的CCS值相结合，可以对单体及聚体同时分析。

二维色谱总结 第4篇

不同于第一种模式需要针对每个目标物峰进行定性，族类分析中只需要对族类总体进行定性确认（一般需要确认族类边界，以及是否有族类之间的重叠）。对于很难进行单组分积分的情况（比如UCM鼓包导致无法对单个化合物进行积分），需要进行族类手动积分。

在第一种和第二种分析模式中，我们需要知道样品的一些基本情况，比如目标化合物或者目标族类。而第三种分析模式中，这样的先验信息可能是不存在的，或者说，这就是这类分析需要得到的结果。比如说，某两个样品表观上具有显著的差异，我们想要知道哪些化学成分影响或者导致了这些差异。这种例子不胜枚举，两个来自相邻油井的原油样品，两种不同产地出产的红酒，不同季节采摘的茶叶，健康人群和患病人群的血液样本。在这些例子中，最终目的是找出影响样品表观差异的关键化学成分（目标物组分或者族类，称为标志物Marker），从而深入了解其化学机理或成因，进而对未知样品进行性质预判或鉴别。要实现这一目的，最直观的方法是分析样品中所有化学成分并对其性质进行关联比较，但这样的方法工作量巨大，实际上根本无法开展。更有效的方法是将样品的整个谱图视为一种“指纹谱图”，并将其中的“指纹特征”和表观性状进行统计关联，从而得到标志物。这样的方法极大程度上依赖于多元统计数据处理技术。

这种模式对色谱系统的要求如下。

二维色谱总结 第5篇

有了上面的介绍，全二维谱图的峰积分就比较容易理解了。大多数全二维数据处理软件都先对原始一维谱图进行峰识别和积分，方法和常规一维色谱基本一样。在将同一个物质的xxx合并后，一个峰包含了多个xxx信息，包括切片数，每个xxx的保留时间，峰高，峰面积等。xxx的保留时间主要由最大xxx（峰高最大的xxx，也称为主xxx）的保留时间确定；将所有xxx峰面积相加就得到该峰的峰面积。还有一种算法是将xxx组合而成的峰先拟合成一个三维的形状，通过计算这个三维峰的体积，得到所谓的“峰体积（peak volume）。

这样一来，问题的关键就在于应该遵循什么原则进行峰合并。之前已经提到过，同一个物质一维馏出的时候被切成很多片，但这些xxx都集中于相邻几个周期内，前后相距时间不会太长，可以认为不同xxx在二维进行分离时的温度基本一致（或者后面的切片经历的温度会略微高一点，如果柱箱设置为程序升温的话），所以他们在xxx上馏出的时间就是纵轴数值应该基本一致。很多算法就是利用这一点，将相邻周期内二维馏出时间接近的峰识别成同一个物质的峰，并将其合并起来。当然除此之外，还需要其他的一些特征条件来认定。另外，如果是质谱数据，也可以将是否含有相同的碎片离子作为一个额外的筛选条件，提高识别准确率和可靠性。现代全二维色谱数据软件都具备自动峰识别、合并和积分计算的功能。

当xxx的合并和积分计算完成后，就得到一个峰列表（Peak Table），包括识别成功的xxx的信息，包括一维保留时间、二维保留时间、峰面积等。用户可在峰列表上选择任意一个峰，软件就会显示组成xxx的所有xxx的信息，同时该峰主切片所在周期内的原始数据也会显示出来，方便用户观察原始峰型和分离细节。如果是质谱数据，还可以看到离子图，以及和NIST图库的匹配结果等信息。

二维色谱总结 第6篇

HIC-SEC、SEC-SEC中，xxxSEC只是起到一个脱盐的作用，然而二维RPLC可以自上而下提供更多的峰信息。在RPLC中，由于变性条件(酸性pH，高有机含量，高温等) ，在半胱氨酸连接的ADC中，会导致弱非共价键的解离，从而形成更小的xxx。在HRMS之前和HIC、SEC或CEX之后的2D RPLC可以对分离的物种进行更精确的结构解析。HIC-RPLC-UV-HRMS，一维HIC分离不同DAR值的物质，二维RPLC提供MS兼容体系(三氟乙酸+甲酸水/乙腈)。可以去除第一维度HIC中使用的非挥发性盐( M乙酸铵和 M磷酸盐缓冲液)，二维液相中将盐以废液形式排出（图4所示）。为得到更好的分离效果。需要对1维和xxx方法进行优化。主要包括注射溶剂的性质、固定相、盐的类型、盐的浓度和梯度条件。例如可以在一维液相流动相中增加盐浓度来降低其洗脱能力以改善峰型。对于二维液相，降低溶剂效应尤为重要。不相容的流动相可能导致峰展宽甚至峰变形，进而导致整体峰容量和峰强度的降低。HIC-RPLC-UV-HRMS方法可以识别到不同DAR值组分的位置异构体。图7所示。HIC分离后，样品进入RPLC，在RPLC的变性条件下，ADC分为xxx结构，并根据疏水性进行分离。分离产物经MS鉴定。DAR6的四个预期xxx的存在表明DAR6的两个位置异构体被明确识别。

这种方法也可以识别到奇数的DAR。等高线如图8所示：奇偶DAR的结构解析，水平虚线表示在HIC中分离的DAR种类，垂直虚线表示在RPLC中分离的不同亚单位。

奇数DARs(1,3和5)及其相关的位置异构体可以被明确识别。在MS检测中，非常大的xxx(MW >100 kDa)难以电离。然而，通过保留时间和MS数据的信息可以预测不同xxx的保留时间。如图9所示，不同xxx的保留时间与药物载量之间的关系。xxx保留时间与偶联药物数量之间具有良好的线性关系。 从这些拟合直线，可以预测任何未识别xxx的保留时间。通过图10所示的2D-UV轮廓图，可以快速进行不合格批次和合格批次之间的可视化比较。

二维色谱总结 第7篇

到目前为止，已有很多全二维气相色谱仪应用的例子。其有用性正逐渐被人们所认识，可能的应用领域会比已开展的广泛的多。一般来说，当样品中物质的个数多于100时，使用全二维气相色谱仪会比一维GC好得多。当柱系统选择得当时，此种技术更适于需族分离的复杂样品分析。即使样品中物质个数在30~100间，全二维气相色谱仪也会具显著优越性。

1、石油样品

石油样品是Z常见的复杂混合物，它一般是由2~4族化合物组成的复杂混合物。在C10~C25范围(类似于柴油的碳数分布)，大约有4×10^7饱和烃异构体有可能存在。尽管只有其中的一小部分实际存在于这些样品中，十分明显的是，单柱GC来分离诸如柴油这样复杂的样品，有峰容量不足的严重缺陷。

Blomberg等应用全二维气相色谱仪对石油产品的分析已做了大量的工作，重汽油、重催化裂解循环油等均得到了很好的分离。Frysinger等分离了汽油中的苯、甲苯、乙苯和二甲苯(BTEX)及总烃，并用全二维气相色谱仪与四极质谱联用来分析海中的柴油燃料。全二维气相色谱仪也被Gaines等作为用来识别溢油来源的Z好工具。Xu等在全二维气相色谱仪中用全甲基羟丙基β-环糊精作xxx柱子，从煤油中分出了1万多个峰。Synovec等则使用全二维气相色谱仪分离了汽油中的甲苯、乙苯、间，对-二甲苯和丙苯混合物，并研究了GRAM方法在定量中的有用性。Kinghorn等用煤油作样品来测试冷阱调制器的有用性和可靠性。相同的小组也将此技术用于原油样品的分析，其轮廓图与应用热调制方式得到的相当类似。

2、环境样品

无论是天然的，还是人类影响，环境中存在极端复杂的样品。如果我们要了解环境，就要了解这些复杂混合物的化学。而这需要详细的分离和分析。

对环境中持久的卤化物的分析一直具有相当的兴趣。多氯联苯(PCBs)、氯化硼 烷和氯化莰烯的分析，对分析化学家具有Zda的挑战性。PCBs共有209个氯代联苯化合物，仅150个在商用产品中出现。尽管自1977年后PCBs的生产已停止，但对PCBs的关注将会持续下去。不同PCB有不同的毒性、生物积累行为和分解路径等，只测总量意义不大，需要对感兴趣单组分进行逐个分析。气相色谱法由于其GX分离的特性，成为shou选的方法。到目前为止，尽管已进行相当多的工作，但尚不能发现一个单柱条件可以分离所有感兴趣的PCBs。deGeus等使用半-GC´GC分离了非-邻位氯苯CBs77、126和169及一个工艺PCB混合物Aroclor1254。结果表明，一次分离可分析所有感兴趣组分，而用通常的ZX切割-多维色谱法则需要很多次运行。Xu等也发展了一个方法以使相同氯原子数的PCBs在全二维气相色谱仪平面上得以分离。

毒杀芬也是一组含氯物质，由几百个化合物组成，大约197个为硼 烷和莰烯衍生物。与氯代二恶英和氯代苯并呋喃一样，都是环境关注的化合物。可以预料，全二维气相色谱仪对它们的分离分析也将发挥积极作用。

农药分析是另一个相当常规的领域。食品和环境中均要对其进行监测。Liu等应用全二维气相色谱仪分析了人血清中的农药。尽管这是一个简单的样品，但使用GCxGC二维色谱容易解决干扰问题，分析速度也得以加速。

除上述工作外，Gaines等使用全二维气相色谱仪测定了水样中的痕量含氧化合物和芳烃，并使用全二维气相色谱仪来识别表面水中轻微风化的柴油燃料的溢出源。

3、其它应用及发展展望

可以想象，由于全二维气相色谱仪的高度峰容量和分辨率，这个技术将会在复杂体系的分离分析中占据越来越重要的地位。这些典型的复杂样品包括：阻燃剂如多氯联苯(PCBs)、多溴二苯醚和联苯(PBDEs和PBBs)，氯代烷(PCAs)，多氯萘(PCNs)，香气如多环麝香化合物，氯代二恶英和呋喃，农药和除草剂如毒杀芬和多氯三苯(PCTs)，石化产品、精油及食用油等。复杂体系中的手性物质的分离，全二维气相色谱仪技术也会发挥很大作用。对咱们ZG来说，传统中草药中挥发性化合物的分析和传统名白酒中香味成分的分析也是此种技术发挥作用的地方。

应该指出，尽管全二维气相色谱仪Z适合于分离复杂混合物，但它也适用于对相对简单的混合物进行快速扫描分析。

由于全二维气相色谱仪作为一个技术还很年青，现仅有一种商品仪器。许多深入研究有待进行。如果在一台仪器上同时具有热调制和冷调制的功能，对全二维气相色谱仪扩展样品分析的范围将非常有帮助。同时，全自动的、用户友好的、能处理由全二维气相色谱仪检测器产生的大量数据的软件程序(工作站)尚需进一步的发展、完善。化学计量学如模式识别有助于快速识别轮廓图中的化合物组成。全二维气相色谱仪与选择性检测器的联用将进一步增强其有用性，减少样品制备的时间。TOF-MS与全二维气相色谱仪联用对二维色谱的定性分析将非常有帮助。完全可以说，全二维气相色谱仪技术的将来是非常明亮的。